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Key words: Heterogeneous disorders, molecular genetic
diagnosis, Sanger sequencing, fragment analysis, multiplex
amplification of ligation dependent probe, methylation
analysis, genomic molecular diagnosis, next generation
sequencing, gene panel, exome, genome, comparative genomic
hybridization array.
INTRODUCCIÓN
Según el catálogo OMIM
(Online Mendelin Inheritance in Man),
en la actualidad se conocen alrededor de 8.000 enferme-
dades genéticas relacionadas con todas las especialidades
médicas, la mayoría de ellas de tipo monogénico. Sin
embargo, su base genética se conoce en 4.423 entidades
patológicas, lo que representa que en el 50% de enfer-
medades no se ha demostrado la relación genotipo-feno-
tipo (1). Por otro lado, la Organización Mundial de la Salud
(OMS), estima que estas 8.000 enfermedades afectan al 7%
de la población mundial (2). Según el informe de la Organi-
zación Europea de Enfermedades Raras (Eurordis), el 80% de
las enfermedades raras son de origen genético (3).
Las enfermedades monogénicas se heredan de forma mende-
liana, siguiendo diversos patrones hereditarios conocidos:
autosómico dominante, autosómico recesivo, ligados al X,
ligados al cromosoma Y, disomía uniparental y trastornos de
imprinting
(1). La mayoría están causadas por variantes pato-
génicas localizadas preferentemente en las regiones codifi-
cantes e intrónicas adyacentes de los genes, produciendo
alteraciones de la proteína, modificando su función y provo-
cando el fenotipo patológico. El diagnóstico genético se basa
en la localización de dichas variantes en los genes asociados a
las enfermedades.
Debido a la gran heterogeneidad genética que presentan las
enfermedades monogénicas, el tiempo estimado para llegar
al diagnóstico molecular se encuentra entre 1 y 10 años. Este
retraso impide que los pacientes reciban medidas terapéuticas
y de rehabilitación específica para su enfermedad, que sus
familiares puedan entrar en programas preventivos dirigidos
a la detección temprana de la enfermedad mediante estudios
genéticos y que reciban asesoramiento genético sobre bases
reales de la patología en estudio.
La estrategia actual de diagnóstico de enfermedades hete-
rogéneas consiste en iniciar el estudio del gen más frecuen-
temente mutado asociado a la enfermedad mediante
secuenciación Sanger. Si se detecta la variante patogénica, se
confirma el diagnóstico molecular. Si no es así, se continúa
con la secuenciación de los genes más frecuentemente
mutados hasta detectar o no el gen y la mutación causante
de la enfermedad.
La secuenciación masiva ha venido a solventar estos problemas
dado que permite el análisis de todos los genes responsables
de una enfermedad al mismo tiempo. Ello permite econo-
mizar tiempo y dinero, y establecer la etiología genética en la
gran mayoría de las ocasiones.
El objetivo de este trabajo es conocer las tecnologías de
secuenciación masiva aplicadas al diagnóstico y ayudar al
médico a escoger el método molecular más rápido y de menor
coste según la enfermedad del paciente.
1. TÉCNICAS ACTUALES DE ESTUDIO
En 1977, Fred Sanger y sus colaboradores publicaron dos artí-
culos en los que describieron el método de secuenciación del
ADN que ha transformado la biología de nuestros días y sigue
siendo la tecnología de referencia. Se basa en la incorpora-
ción de didesoxinucleótidos trifosfato (ddNTPs) como termi-
nadores de la cadena de ADN (4, 5).
Para llevar a cabo este proceso, se requiere ADN de cadena
sencilla, un cebador de ADN, ADN polimerasa y ddNTPs
con nucleótidos marcados con fluorescencia. Estos ddNTPs
terminan la elongación de la cadena al carecer del grupo
3'-OH, produciendo varios fragmentos de ADN de longitud
variable (6).
Desde su publicación, la secuenciación Sanger ha evolucio-
nado de forma asombrosa permitiendo alcanzar hitos tan
relevantes para la Genética Humana como la secuenciación
del primer genoma humano en el año 2001 (7), o la caracteri-
zación del primer haplotipo humano por el consorcio HapMap
(8). Sin embargo, tanto la inversión económica como el
tiempo dedicado a estas tareas obligaron a desarrollar nuevas
tecnologías de secuenciación más eficientes y baratas. De esta
forma, surgieron las primeras plataformas de secuenciación
masiva, abriendo una nueva era en las tecnologías de secuen-
ciación y planteando un nuevo paradigma que se acaba de
alcanzar al conseguir la secuenciación de un genoma por
$1.000 (9, 10). Figura 1.
2. SECUENCIACIÓN MASIVA
La nueva generación de plataformas de secuenciación masiva
o
‘Next-Generation Sequencing’
(NGS), inician su actividad
comercial en el año 2005 generando una auténtica revo-
lución en la investigación biológica. Si bien es cierto que la
secuenciación tradicional mediante la tecnología Sanger ha
dominado el campo de la investigación y el diagnóstico mole-
cular durante al menos dos décadas, la vertiginosa evolución
de estos nuevos secuenciadores, tanto en precisión como en
rendimiento, así como el abaratamiento del coste por base
[EL DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE ENFERMEDADES GENÉTICAS - Sonia Santillán MD PhD y cols.]