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mismo fragmento de ADN. Esta estrategia de secuenciación
facilita no solo el posicionamiento de aquellas lecturas que
pueden mapear en múltiples sitios sino que también posibilita
la identificación de variantes estructurales.
A pesar de todas estas particularidades comunes, cada plata-
forma de secuenciación masiva se basa en principios químicos
distintos que generan diferencias cualitativas y cuantitativas.
2.1. Secuenciador 454-Roche
Fue la primera empresa en lanzar al mercado una plataforma de
secuenciación masiva, cuya química está basada en la pirose-
cuenciación. Esta tecnología consiste en la detección de señales
luminosas generadas a partir de grupos pirofosfato liberados
tras la polimerización de un nuevo nucleótido complementario
a una hebra de ADN molde. En sus inicios, este primer secuen-
ciador despertó muchas dudas en la comunidad científica pese
a presentar grandes ventajas respecto a la secuenciación Sanger,
tales como el gran abaratamiento del coste de secuenciación por
base (1/6 de lo que suponía en aquel entonces la secuenciación
Sanger) y el gran aumento en la cantidad de información gene-
rada, equivalente a 50 secuenciadores Sanger. Más tarde, estos
secuenciadores han evolucionado muy deprisa y actualmente
la cantidad de información que generan es muy superior a su
primera versión llegando a alcanzar 2Gb y una longitud de lectura
de 700 a 1000 nucleótidos dependiendo de la versión (22).
2.2. Secuenciador
SOLID
El secuenciador SOLiD emplea una tecnología de ligación de
oligonucleótidos marcados y es capaz de interrogar dos bases
al mismo tiempo, de manera que, tras varias rondas de liga-
ción y detección de fluoróforos, cada nucleótido es leído dos
veces dando lugar a un nuevo tipo de codificación, que se
denomina “
double-encode
” o “código de colores”, en el que
cada color identifica dos bases consecutivas. Este proceso no
se realiza con el primero y el último nucleótido. La longitud
de las lecturas en la plataforma SOLiD alcanza los 75 nucleó-
tidos y puede llegar a generar hasta 200 Gb de datos (23).
2.3. Secuenciadores de Illumina
La plataforma Illumina se basa en la incorporación de nucleó-
tidos marcados con terminadores reversibles de manera que
en cada ciclo de ligación solamente uno de los cuatro nucleó-
tidos posibles se une de forma complementaria al ADN molde
emitiendo una señal luminosa que es captada por un sistema
óptico altamente sensible. Posteriormente, el terminador se
elimina para permitir la incorporación del siguiente nucleótido
en ciclos sucesivos de secuenciación. La química empleada por
Illumina permite generar lecturas de hasta 150nt llegando a
producir hasta 1500 Gb en datos (24).
Por otro lado, la dificultad de reunir un número mínimo de mues-
tras que justifiquen económicamente la puesta en marcha de
un proceso completo unido al alto coste de adquisición de estos
equipos impulsaron el desarrollo de una nueva serie de secuencia-
dores más económicos, capaces de generar una menor cantidad
de datos con la misma precisión que las plataformas grandes
de secuenciación masiva. En este contexto, se han desarrollado
las siguientes plataformas: Secuenciador GS Junior de Roche,
Secuenciador MiSeq, de Illumina, Secuenciador Ion Torrent de
Applied. Estas plataformas se han extendido rápidamente dotando
a pequeños laboratorios de la tecnología de secuenciación más
avanzada.
2.4. Desarrollo de nuevas plataformas de tercera generación
Las nuevas plataformas que se encuentran en desarrollo,
conocidos como secuenciadores de tercera generación,
permiten la secuenciación de una única molécula de ADN
(single-molecule sequencing)
evitando la amplificación de los
fragmentos de ADN mediante PCR. De esta forma, se evitarían
las desviaciones generadas durante el proceso de amplifica-
ción y, al mismo tiempo, se reduciría el tiempo de trabajo y el
precio global de secuenciación. Algunas de estas plataformas
son:
- Secuenciador SMRT de la empresa
Pacific Biosciences
, dispo-
nible comercialmente desde abril de 2011, basado en el
uso de chips (tecnología
Single
Molecule
,
Real
Time
o
SMRT
)
que contienen miles de pocillos en cuyo fondo se encuentra
anclada una única proteína polimerasa que permite llevar a
cabo la incorporación de nucleótidos marcados en tiempo real
(750nt/sec) (25).
- Oxford Nanopores capaz de detectar nucleótidos indivi-
duales a su paso a través de un nanoporo (26).
Esta última generación de secuenciadores promete nuevas
alternativas aún más baratas y con la posibilidad de resolver
algunos problemas asociados a los secuenciadores actuales,
tales como el estudio de expansiones, detección de variantes
de número de copia o trastornos de metilación, así como la
disminución de tiempo total de secuenciación. Sin embargo,
continúan algunos desafíos significativos de NGS referidos al
almacenamiento y procesamiento de datos.
3. DESDE LA INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA HACIA
EL DIAGNÓSTICO CLÍNICO MEDIANTE LA
SECUENCIACIÓN MASIVA
Tras la secuenciación del genoma humano los avances en
la investigación y el desarrollo tecnológico han producido
un profundo impacto en el progreso científico. El éxito del
proyecto original dio lugar al lanzamiento de muchos otros
esfuerzos internacionales cuyo objetivo común ha sido el
[EL DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE ENFERMEDADES GENÉTICAS - Sonia Santillán MD PhD y cols.]